胚胎植入前染色体非整倍体检测(PGT-A)

背景介绍

什么是植入前遗传学诊断/筛查PGD/PGS)?

植入前遗传学诊断/筛查(Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD/PGS)是指在人工辅助生殖过程中,对胚胎进行种植前活检和遗传学分析,以选择无遗传学疾病的胚胎植入子宫,从而获得正常胎儿的诊断/筛查方法。这2种技术建立在IVFin vitro fertilization,体外受精)基础之上,可直接筛除有问题的、不健康的胚胎,挑选正常的胚胎植入子宫,可阻断致病基因的纵向传递,降低反复流产率,提高患者的临床妊娠率,避免因引产给孕母带来的身心创伤。

2018年世界卫生组织根据PGD的创始人Alan H Handyside的建议对PGD/PGS给出的新定义。PGD又称为PGT,包括PGT-M,即胚胎植入前单基因遗传病检测(Preimplantation Genetic Testing for Monogenic),和PGT-SR,即胚胎植入前染色体结构异常检测Preimplantation Genetic Testing for chromosomal Structural Rearrangements)。PGD主要针对事先已经明确病因的遗传性疾病患者,在种植前对胚胎进行相应遗传学诊断,分别为单基因病(如地中海贫血、遗传性耳聋等)和染色体病(如罗氏易位、相互易位等)。

PGS又称为PGT-A,即胚胎植入前非整倍体检测(Preimplantation Genetic Testing for Anueploidy)。PGT-A主要针对高龄、反复助孕失败、反复自然流产等患者,进行植入前胚胎的染色体非整倍性检测。

为什么要进行胚胎植入前非整倍体检测(PGT-A

由于当今社会不孕不育的现象越来越普遍,人们对辅助生殖的需求也越来越大。胚胎染色体数目异常在体外受精中较常发生,会引起植入失败或胎儿异常是导致人类辅助生殖失败的一个重要原因。

尽管体外受精-胚胎移植(in Vitro Fertilization and embryo transferIVF-ET)可以用于不孕的治疗,但这个过程还是低效的,成功率仍然较低。传统的试管婴儿过程中,植入胚胎的挑选主要依靠医生在显微镜下对胚胎形态进行鉴定判断。依靠这种方法,不少植入胚胎不能成功着床或持续妊娠,其主要原因之一是形态学评估较好的胚胎仍可能存在染色体非整倍体异常,因而失去了正常发育的能力

下图显示形态学均正常的胚胎有不同的染色体情况:经基因芯片检测发现,A核型正常(46,XX),B核型异常(45,XY,-12)。




PGT-A可有效提高体外辅助生殖成功率,已被广泛应用于临床实践中。

一篇研究PGT-A在复发性自然流产患者中应用的文章显示:通过行PGT-A,选择染色体正常的胚胎进行移植,可以有效筛选出染色体异常的胚胎、提高临床妊娠率和降低自然流产率。文章对20176~20194月在新疆佳音医院生殖医学中心就诊的85例复发性自然流产患者,分为行 PGT-A 组(n = 34)和未行PGT-A 组(n = 51用单细胞全基因组扩增(WGA)和二代测序技术(NGS)对行 PGT-A 组胚胎染色体进行筛查,选择染色体正常的胚胎进行移植,对两组临床结局进行比较发现:行PGT-A检测的复发性自然流产患者胚胎染色体异常率为42.86% 54/126),其中15例行单胚胎冻融移植,临床妊娠率66.67%10/15),高于未行PGT-A组(45.1%),行PGT-A组的自然流产率20%2/10)显著低于未行PGT-A组(26.09%)。


PGT-A的检测样本有哪些?

根据活检时机的不同可分为极体活检、卵裂球活检和囊胚滋养层细胞活检。

什么是极体活检?优缺点是什么?

极体活检:极体活检包括MⅡ期卵细胞和/或合子中进行极体的活检,分为第一极体活检和第二极体活检。第一极体活检于取卵当天即HCG注射后36~42h进行,第二极体活检在受精观察当日。可在受精后9~22h内同时活检第一极体和第二极体,但是受精22h第一极体有可能发生降解。极体活检用于PGD/PGS基于:极体是卵子减数分裂过程中的产物,根据其检测结果可以间接推测卵子的遗传信息,从而预测来自母亲的遗传缺陷对胚胎的影响。

² 优点极体活检相比植入前其他阶段具有较少的侵入性,来自第一次减数分裂的第一极体或来自第二次减数分裂的第二极体,对于植入前及植入后胚胎的发育影响较小

² 缺点:由于极体活检只能间接反映母方遗传信息,临床应用较为局限。由于有丝分裂和父系来源的非整倍体性不能被检测到,同时极体活检尚不能预测胚胎的发育状况活检样本量多,也存在无效活检。极体活检结果也需要胚胎活检结果的验证

什么是卵裂球活检?优缺点是什么?

卵裂球活检:卵裂球活检是在胚胎发育6~8细胞左右时,吸取1~2个卵裂球进行遗传学检测。此阶段的卵裂球被认为具有全能性。

² 优点:与极体活检相比,卵裂球活检的优势在于可以同时诊断父方和母方染色体异常或单基因疾病。卵裂球活检直接检测胚胎的遗传信息,并且可以剔除未受精和质量差的胚胎减少活检样本数量

² 缺点:分裂期胚胎活检减少胚胎细胞数量,可能损伤胚胎,降低胚胎发育潜能。分裂期胚胎有40~60%嵌合体,对于嵌合体胚胎,卵裂阶段单个卵裂球的检测并不能完全代表整个胚胎的遗传信息,导致漏诊和异常胚胎的移植

什么是滋养层细胞活检?优缺点是什么?

滋养层细胞活检:滋养层细胞活检是在受精后5~6,胚胎发育至囊胚阶段时,取一定数量的滋养层细胞用于遗传检测。囊胚阶段胚胎细胞数量显著增加,获得的滋养层细胞数可达10个,能够提供更多的细胞用于检测,从而提高结果的准确性。

² 优点:此阶段胚胎嵌合减少,也提高了检测的准确性,并且滋养层细胞将来发育成胎盘,降低了活检对胚胎发育的影响

² 缺点:滋养层细胞活检需要胚胎发育到囊胚阶段,要求具备一定的胚胎培养条件,胚胎有持续发育能力。约有40%的正常受精卵可在体外发育至囊胚阶段,也限制了可供检测的胚胎数目。滋养层细胞活检结果也可能存在与内细胞团的不一致性,如下图所示:


应选用什么时期的胚胎细胞进行活检?

卵裂球活检和滋养层细胞活检是常用的胚胎活检时机。

随机配对试验结果显示,滋养层细胞活检没有降低胚胎种植潜能(滋养层细胞活检与未活检者的种植率为51% vs 54%),而卵裂球活检显著降低了胚胎种植潜能卵裂球活检与未活检者的种植率为30% vs 50%PMID:23773313。比较滋养层细胞活检(Day 5活检,Day 6移植)和卵裂球活检后培养至囊胚移植(Day 3活检,Day5移植)的临床结局显示,滋养层细胞活检的诊断率和胚胎种植率均高于卵裂球活检94.3%47.6% vs 75.2%26.7%PMID:17261575

鉴于囊胚期活检的优势,越来越多的PGD/PGS采用滋养层细胞活检方式

胚胎分裂期和囊胚期细胞活检数量对囊胚发育临床诊断率及种植率的影响是什么?

分裂期胚胎可以活检1~2个细胞。相对于活检对胚胎造成的损伤而言,分裂期胚胎本身的质量与囊胚发育率之间的相关性更高。活检2个细胞较1个细胞降低囊胚发育率。但活检1个细胞降低了PCR的诊断效率88.6% vs 96.4%),而对FISH方法的诊断效率没有影响PMID:18156649。两者的活产率相当。

胚胎发育至囊胚时大约有100~150个细胞,可以提供更多的细胞用于检测。滋养层细胞活检时,诊断率随活检细胞数的增加而提高,1~5个细胞的诊断率从86.7%上升到98.7%,当活检细胞大于6个细胞时诊断率达到最大PMID:26820770。而滋养层细胞活检数量对临床结局的影响则和滋养层本身的发育状况紧密相关,当滋养层细胞达到A级标准时,活检细胞数量的多少对胚胎存活和种植率没有显著影响,而当滋养层细胞在BC级时,活检细胞数量虽然对胚胎存活没有显著影响,但胚胎种植率随活检细胞数量的增加而下降。因此,《胚胎植入前遗传学诊断与筛查实验室技术指南》建议:滋养层细胞达到A级标准可活检6个以上细胞,达不到A级标准时活检3~6个细胞。

研究胚胎活检对新生儿结局的影响,显示胚胎活检后虽然出生胎龄降低,但活检本身不会对宫腔内生长限制或者低体重造成影响。

PGT-A的主要流程是什么?

① 遗传咨询与知情同意。

② 夫妻双方通过体外辅助生殖技术获取胚胎:体外受精(IVF卵胞浆内单精子显微注射(ICSI均可,建议授精采用ICSI方式,以避免亲源遗传物质的污染

③ 胚胎活检:卵裂球活检和滋养层细胞活检均可,建议采用滋养层细胞活检滋养层细胞达到A级标准可活检6个以上细胞,达不到A级标准时活检3~6个细胞

④ 将获取的活检样本送到实验室进行单细胞扩增、高通量测序与遗传分析

⑤  PGT-A 检测结果中未见染色体非整倍体异常的胚胎在复苏周期中移植入宫腔将剩余的胚胎冷冻储存供将来使用


PGT-A检测方法是什么?

方法

时间

原理

优缺点

PCR

1990

通过对基因组特定区域的特异性扩增,结合凝胶电泳、酶切、测序等技术,可以检测胚胎性、特定基因的点突变、小片段缺失或插入等,也可以通过qPCR 检测染色体整倍性

主要应用于单基因病的诊断PGDPCR技术面临污染和等位基因脱扣的挑战,容易出现假阳性或假阴性的结果而导致误诊,因此建议和突变点附近的分子标记检测联合使用,以降低误诊率

FISH(荧光原位杂交)

1994-1998

利用荧光标记的特异性探针与处于间期的胚胎卵裂球DNA杂交,在荧光显微镜下观察荧光信号的数量与分布,反映相应染色体的数目与结构

用于检测131415182122XY 染色体数目异常,可通设置特异性探针实现对倒位或者平衡易位的检测。但FISH使用的探针数目有限,仅对部分染色体异常进行检测,此外受卵裂球固定效果和探针的非特异性结合等影响检测结果难于判断,有逐渐被其他方式取代的趋势

Array CGH

1999

利用不同颜色的荧光标记待测样本和正常基因组的DNA,然后与正常人类中期染色体或芯片进行杂交,通过对比分析两种荧光强度,反映待测样本DNA信息

aCGH可在基因组水平检测染色体数目变化以及重复、缺失的情况,但是这种方法不能区分其分辨率以下的片段缺失和重复,不能检测整倍性的改变如三倍体胚胎、单亲二倍体

SNParray

21世纪

对基因组范围SNP位点的检测同时可以反映染色体数目异常及片段异常

优势在于分辨率高,分析染色体数目和片段异常的同时可以诊断单亲二倍体

NGSCNV-seq

21世纪

大规模平行测序技术获得序列信息,与人类基因组数据库序列进行比对,分析染色体数量变化与片段异常

测序费用持续下降,对一个胚胎的基因组进行细致全貌的分析成为可能,将PGS带入全新的领域


对于PGT-A,现在arrayCGHSNParrayNGS技术已取代多轮杂交FISH技术。随机对照研究比较NGSaCGH两种方法行PGT-A的临床结果发现,NGS能够100%检测24条染色体的非整倍体,结果和公认的aCGH的结果一致。NGS法行PGT-A后囊胚移植妊娠率达到74.7%,胚胎种植率达70.5%,与aCGH方法没有显著差异(PMID:26100406)。对aCGHSNParrayNGS三种方法对24条染色体整倍性检测的一致性研究显示,通过对30个囊胚活检结果的分析比较,发现这三种方法对非整倍体胚胎的检出率均为100%,进一步对720条染色体的分析发现,NGSaCGH的一致性为99.31%,与SNParray的一致性为99.58%,均具有较高的一致性(PMID:26902859)。

NGSCNV-seq)用于PGT-A的优势是什么?

² 检测范围广:覆盖全染色体非整倍体、大片段缺失/重复及全基因组CNV

² 高通量:通量远高于核型分析、FISH和基因芯片;

² 操作简便:实验流程简便,数据分析自动化程度高,质控标准清晰,报告周期短,可在显著节省人力的同时降低人为误差风险;

² 兼容性好:一台高通量测序仪可同时进行无创产前筛查(noninvasive prenatal screening, NIPSCNV-seq,有效节约实验室的空间和设备成本;

² 低比例嵌合体的检测:与基因芯片相比,CNV-seq可以检测更低比例的嵌合体。


产品介绍

胚胎植入前非整倍体检测(PGT-A的适用人群有哪些?

女方高龄女方年龄35岁及以上

不明原因反复自然流产:反复自然流产2次及以上;

不明原因反复种植失败:移植3次及以上,或移植高评分卵裂期胚胎数4-6个,或高评分囊胚数3个以上均失败;

生育过染色体异常疾病患儿的夫妇

染色体数目及结构异常(如平衡易位)的夫妇

医生诊断为需要进行PGT-A的其他人群。

检测内容是什么?

通过单细胞扩增技术结合高通量测序技术对辅助生殖过程中体外培养的卵裂期或囊胚期滋养层细胞进行检测,可检测出24条染色体非整倍体,分辨率低至4Mb片段缺失和重复,以及不低于20%的染色体低比例嵌合等染色体异常。

检测意义是什么?

染色体非整倍体是导致试管婴儿流产及妊娠失败的主要原因,临床医生根据检测结果可选择染色体正常的胚胎植入。

提高试管婴儿临床妊娠率;

降低流产率;

提高单胎植入成活率,避免多胎植入导致的高风险;

减少了所需的体外受精周期,潜在地减少了怀孕周期以及额外周期所需的成本

检测流程是什么?

遗传咨询 > IVF/ICSI > 胚胎活检 > 全基因组扩增 > 高通量测序 > 数据分析 > 检测报告 > 胚胎移植


检测周期多久?

从样本检测合格之日起,10个自然日内将检测报告以电子和/或纸质两种形式发送到受检者和送检医生所留邮箱和地址。

样本类型及保存方法

分裂期胚胎(卵裂球活检):1~2细胞;

囊胚期滋养层细胞(滋养层细胞活检):滋养层细胞达到A级标准可活检6个以上细胞,达不到A级标准时活检3~6个细胞

玻璃化冷冻是活检胚胎冷冻保存的可行且有效方法

产品优势是什么?

覆盖度高:包括24条染色体非整倍体,染色体嵌合体;

精准度高: 可检测4Mb 以上的片段缺失和重复,比例低至20%的嵌合体;

报告周期短:10个自然日出具报告;

物流链完善:-20℃冷链运输体系。

报告可能出现的结果与移植建议是什么?


结果

整倍体

非整倍体

嵌合体

图示

每个细胞染色体数目

正常

异常

混合(部分正常&部分异常)

成功妊娠的可能性

不太可能

低,但有可能

移植建议

建议

不建议

在没有完全正常胚胎的情况下,可以考虑移植嵌合胚胎,但是需要考虑嵌合类型以及嵌合比例:整条染色体大于30%嵌合判断不建议移植。大于等于20%嵌合判断为谨慎移植。


检测的局限性是什么?

本检测不适用于检测 SNPindel,不足4Mb片段缺失和重复、低比例嵌合变异,以及染色体特殊结构异常如染色体平衡易位、倒位、环状等

本检测不报告性染色体(性别),若性染色体有异常情况会在报告中展示。

本检测无法检出整套染色体三倍体或多倍体的胚胎(如 69,XXX),单亲二倍体或部分单亲二倍体。

本检测不适用于检测高重复序列区域,如近着丝粒、端粒、异染色质等区域;

本检测不适于对单基因病、多基因病以及线粒体病进行检测。

检测须知

PGT-A取材有限,只是取一定数量的卵裂球或者囊胚期(滋养层)细胞,而部分胚胎(滋养层)存在嵌合的情况,即取材细胞和留下继续发育的细胞团遗传构成并非完全相同,前者的检测结果并不能完全反应后者的真实情况,故检测结果无异常的胚胎不能完全排除存在染色体异常的风险
选择PGT-A成功受孕后,孕妇仍然需要进行常规的产前检查。虽挑选了健康胚胎,但是胚胎移植后,生命发育任何一个阶段胎儿由于母体原因、环境等因素,染色体都有可能出现异常变化;
PGT-A不可替代产前筛查。若常规产前检查发现胎儿异常,或孕妇本人具有进行产前筛查的指征,强烈建议孕妇选择羊水穿刺等产前筛查方式进行确认。

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