MLPA多重连接探针扩增技术

发布日期:2020-07-01

原理

MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交,之后通过连接、PCR扩增,产物通过毛细管电泳分离及数据收集,分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段,一个由化学合成,一个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中,两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异,只有当两个探针与靶序列完全杂交,即靶序列与探针特异性序列完全互补,连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有一个碱基的差别,就会导致杂交不完全,使连接反应无法进行。连接反应完成后,用一对通用引物扩增连接好的探针,每个探针的扩增产物的长度都是唯一的,范围在130~480bp。最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,Genemarker软件分析,得出结论。只有当连接反应完成,才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰,如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变,那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加,因此,根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。 


应用
检测染色体亚端粒的基因重排
智力低下是遍及全世界的严重危害儿童身心健康的一类疾患,其中一部分是由可知原因引起的,包括感染、中毒、脑疾病等,但是很大一部分患儿的病因不明。近几年的研究发现,包括亚端粒在内的基因重排是引起智力低下的重要原因[M,N],因为亚端粒的基因非常丰富,微小的改变就会累及众多的基因,从而导致疾病的发生。应用较多的检测染色体亚端粒的方法包括染色体核型分析,荧光原位杂交(FISH),但是前者不能检出亚端粒微小的基因重排,而后者费时、费力、又非常昂贵,不易推广。MLPA-P036和MLPA-P070试剂盒,针对每一个染色体的末端都设计有一个特异性探针,它经济、高效、快速,可以用于检测亚端粒的基因重排[P,Q],揭示部分智障患儿的发病原因。
检测染色体的非整倍性改变[S,T]
检测染色体的非整倍性改变的方法主要为染色体核型分析,但是它在检测羊水细胞、绒毛或是其他胎儿细胞时,需要进行体外细胞培养,若培养失败、细胞过少或染色体形态较差时,常常影响实验结果。应用MLPA检测这类标本时,不需要体外培养,少量标本即可进行检测,针对易发生非整倍性改变的染色体(13,18,21,X,Y)上的几个热点基因设计特异性探针,根据特定基因拷贝数的改变,即可确定染色体数目的异常。
检测单核苷酸的多态性(SNP)和点突变
根据MLPA的原理可知,靶序列DNA只要有一个碱基的改变,便可导致杂交不完全,使其扩增产物缺失,因此,MLPA高度特异性的检测可用于多种SNP和点突变。
几种常见的儿童遗传性疾病的检测
1)智力低下综合征
多种已知的智力低下综合征与染色体特定区域的基因改变相关。这些患儿临床表现复杂,个体差异大,缺乏特征性表现,医生很难作出准确诊断。MLPA-P064试剂盒,针对特定的染色体区域设计了43个探针,可以明确几种疾病的诊断[A],包括:1p-缺失综合征,Williams综合征,Smith-Magenis综合征,Miller-Dieker综合征,Digeorge综合征[W],Alagille综合征,Sotos综合征。根据同样的原理,MLPA-P096试剂盒可检测的疾病包括:Wolf-Hirschhorn综合征,Cri du Chat综合征,WAGR综合征,Downs综合征等。
2)X连锁型智力低下
X连锁型智力低下可以分为综合征型和非综合征型,前者具备特征性的临床表现,而后者没有特异性症状,智力低下常常为患儿的唯一表现。已经发现19个基因与X连锁型智力低下相关,MLPA-P106可以检测其中14个相关基因的改变。
3)假肥大型肌营养不良症
假肥大型肌营养不良症包括Duchenne型肌营养不良(DMD)和Becker型肌营养不良,临床表现主要为骨盆带肌和下肢近端肌肉无力,腓肠肌假性肥大等,致病基因位于Xp21.2,包括70多个外显子。疾病的发生与DMD基因的缺失、重复或点突变相关。MLPA-P034和MLPA-P035试剂盒设计了80多个探针可以检测每一个外显子的缺失或重复突变,及部分点突变。
4)Prader-Willi综合征(PWS)和Angelman综合征(AS)
PWS和AS都是由染色体15q11-13缺失或同源二倍体所致。如果是父源性染色体15q11-13缺失或母源性同源二倍体则引起PWS,如果是母源性染色体15q11-13缺失或父源性同源二倍体则引起AS。在人类,父源15q11-13区域存在非甲基化的SNRPN印迹基因,母源性15q11-13区域存在完全甲基化的SNRPN印迹基因。甲基化特异性的MLPA试剂盒ME028采用半定量式的方式可以检测基因拷贝数的改变,探针所识别的DNA序列包括甲基化敏感的核酸内切酶HhaⅠ位点,因此可以分析CpG岛的甲基化状态,从而区别PWS和AS。
5)其他疾病的检测

韦翰斯用MLPA方法还可以用于小胖威力征,新生儿糖尿病,脊髓型肌肉萎缩征,腓骨肌萎缩症1型,成神经细胞瘤、a-地中海贫血等疾病的诊断。成神经细胞瘤是儿童中枢神经系统发生的肿瘤,明确特征性基因的改变对确认神经肿瘤发生的过渡阶段、治疗和预后都有重要意义,为临床提供极大的帮助。


优缺点

MLPA结合了DNA探针杂交和PCR技术,具有以下优点

1、高效:一次反应可以检测45个靶序列拷贝数的改变。

2、特异:可以检测点突变。

3、快速:一次实验可以在24小时内完成。

4、简便:不同的试剂盒操作基本相同,容易掌握。


MLPA虽然具有很大优点,但也有其局限性

1、需要精确测量DNA的浓度,样本容易被污染。

2、不能用于单个细胞的检测。

3、MLPA用于检测基因的缺失或重复,不适合检测未知的点突变类型。

4、不能检测染色体的平衡易位。


针对MLPA的局限性我们还有配套解决方案配合解决。

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